细胞复苏流程
1.从液氮罐中取出冻存细胞 ，放入37℃水浴锅中消融 ，柔和离心后网络细胞沉淀 ；
2.缓慢用移液枪吸去上清 ，参与适量浓度和体积的齐全造就基 ，沉悬细胞沉淀 ，转移至细胞造就皿或细胞造就瓶 ；
3.凭据细胞造就皿或者造就瓶的体积 ，补足齐全造就基 ，放入二氧化碳造就箱中造就观察。
操作中确当苦衷项&幼妙招
① 幼心取出冻存管
很多幼型液氮罐的设计是将细胞冻存在带盖的提篮中 ，提篮会浸没在液氮中。由于提篮中没有孔格的划分 ，细胞冻存管无法摆放整齐。取用细胞时辰 ，尝试人员时时必要逐一查看 ，寻找打算复苏的细胞 ，此过程耗时过久 ，可能会导致其他冻存管内的细胞受损。
通常大型液氮罐会配置成列的冻存架和细胞存储盒 ，取出冻存架和放回都必要安稳幼心处置 ，预防带出大量液氮。罐内液氮较多时 ，可适当在罐口左近停顿 ，等大部门液氮回流后再拎出。
② 急剧消融待复苏细胞
倒匾到筹备复苏的冻存管后 ，不要焦急放入水浴锅 ，先查抄封口膜是否齐全（关于冻存细胞时 ，是否用封口膜的问题 ，有经验的呢 ，城市发现加不加都一样的） ，若是贴了医用胶布 ，胶布是否有破损 ？由于一旦冻存管中有液氮流入 ，直接放入水浴锅中 ，管内压力骤升 ，可能导致冻存管炸裂 ，危及尝试人员。推荐使用内旋的冻存管 ，不宜爆炸。若是只有表旋的冻存管 ，取出后应尽快颠倒/水平搁置数十秒 ，使得液氮流出。
复苏细胞的主题技术 ，简而言之就是快融。从液氮罐中取出的细胞 ，需实时放入37℃水浴锅 ，进行急剧消融 ，期间需一向地柔和摇摆冻存管。最好在两分钟内齐全消融细胞。出于卫生思考 ，有些细胞房没有水浴锅 ，所以好多复苏操作 ，必要在分歧尝试室进行。若是两个尝试室距离较远 ，且尝试室室温较高 ，可提前筹备一只干净的烧杯 ，装入37℃的水作中央缓冲。
把稳
? 复苏时不要让水浴锅中的水 ，流入冻存管中造成传染。
? 复苏过程中要格表注沉无菌操作 ，经水浴锅消融后 ，需对冻存管消毒。最好同时更换手套和口罩 ，全程预防移液器接触管口及管壁。幼妙招：将冻存管放入无菌一次性PE手套中 ，再放入水中消融 ，预防传染也方便操作。
③ 柔和网络细胞
网络细胞前 ，要将所用造就基提前预热并摆放整齐 ，预防现用现配耽搁复苏过程 ，实时让刚复苏的细胞接触正常的成长环境。若冻存液中存在DMSO ，请凭据所用细胞对其敏感的水平 ，判断要不要离心弃除。离心主张 ，一个是去除DMSO ，一个是去除死细胞。
刚复苏的细胞状态比力脆弱 ，应预防屡次奏乐和离心。好比原代细胞在复苏消融后 ，尽量不要进行离心操作 ，直接补足造就基 ，使细胞分散均匀 ，等3-6幼时 ，细胞贴壁后 ，进行换液处置。此方式也合用于其他冻存状态通常的细胞。
④ 造就前 ，计数&活力检测
复苏过程中 ，细胞计数必不成少。准则上 ，冻存前和复苏后 ，都必要对细胞进行计数和活率分析 ，判断冻存的成效和细胞复苏后的状态。
2018年9月 ，美国药典（USP-NF）出台了关于细胞冻存有关政策并明确指出 ，台盼蓝不能很好地鉴别刚复苏的细胞（细胞的种类和台盼蓝的浓度分歧 ，对染色了局都有较大的影响） ，建议使用两种以上的步骤进行细胞计数 ，如结合荧光染色计数法。
⑤ 支原体或细菌的传染。分离造就物 ，检测支原体。清洁支架或造就箱。如发现支原体传染 ，抛弃造就物。建议使用的造就基提前用一次性真空过滤器过滤一下 ，能有效除去支原体、细菌等 ，0.1μm的过滤器能够去除支原体 ，0.22微米去除细菌。
⑥ 复苏的细胞自身状态不好 ，已经老化 ，失去贴附性 ，建议启用新的保种细胞。若是细胞比力宝贵或没有备份细胞 ，可尝试将不贴壁细胞网络离心 ，再用 PBS 将沉淀洗濯一遍 ，离心后的沉淀参与胰酶沉新消化接种 ，同时提高血清浓度到
15%~20%。
复苏后是否成功 ，凭据接种后细胞的状态和贴壁率而定 ，倘若第二天有95%以上的细胞贴壁 ，且状态优良 ，则注明复苏成功。复苏接种的时辰 ，选取较高的接种密度 ，使细胞的整体密度高一些 ，有利于细胞的成长。
