尝试筹备： 细胞 ，24孔板 ，细胞幼室（8μm ，24孔板专用） ，ECM Gel ，10%FBS+造就基 ，无血清造就基 ，10 μ、200 μL、1000 μL移液器及配套枪头 ，1.5 mL EP管 ，冰盒
尝试设计：
尝试分组通常分为
阴性组（高低层均没有趋化成分） ，
尝试组（依照尝试必要 ，上层或者基层参与趋化成分） ，
对照组（趋化成分与尝试组中的相反）。若是有出格必要 ，能够再加上
阳性组（高低层都有趋化成分）。
尝试操作（请细读当苦衷项）：
一、细胞侵袭尝试
1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻 ，尝试前转移到冰盒中。
2.将1.5 mL EP、枪头河注细胞幼室放在24孔板里面后 ，置于冰上预冷。
3.凭据自己的使用量 ，依照ECM Gel : 无血清造就基=1 : 7.5在冰上稀释成使用液。
4.把枪头剪去一幼段（约3 μm）后在冰上汲取40 μL/孔ECM Gel使用液轻轻参与幼室上室中 ，参与时慢慢移动枪头 ，保障液体平铺在底部。
5.放在37 ℃孵箱15 min ，让胶凝固。
6.消化、离心、计数细胞后 ，依照2.5x10^4 / mL用无血清造就基稀释细胞 ，造成细胞悬液（若是细胞好多 ，这一步能够提前 ，在4、5之前做）。
7.依照每孔200 μL ，将细胞悬液参与幼室上室 ，同时在幼室下室参与10%FBS+造就基500 μL ，放入37 ℃孵箱造就。
8.若干幼时后取出 ，吸去幼室上室有余液体 ，用PBS洗濯两次 ，用棉棒在上室中轻轻动弹 ，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。
9.在上室中参与结晶紫染液 ，染色5 min ，回收染液 ，用流水缓缓冲去染液 ，再次用棉棒在上室中轻轻动弹 ，吸干水分。 10.在正置显微镜上搁置一块载玻片 ，将细胞幼室的幼孔颠倒放在上面 ，拍照。
11.在100倍视野下 ，对膜的高低左右及中央计数 ，做均匀数。
二、细胞迁徙尝试
细胞迁徙尝试不必要ECM Gel包被 ，其余步骤一致。
尝试道理：多孔膜是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane） ，膜带有微孔 ，孔径大幼有0.1－12.0 μm。将细胞幼室放入对应的造就板中 ，幼室内称上室 ，造就板内称下室 ，上室内盛装上层造就液 ，下室内盛装基层造就液 ，高低层造就液以聚碳酸酯膜相隔。将细胞种在上室内 ，由于聚碳酸酯膜有通透性 ，基层造就液中的成分能够影响到上室内的细胞 ，从而能够钻研基层造就液中的成分对细胞成长、活动等的影响。
细胞迁徙和侵袭尝试常用8.0μm膜 ，上室种肿瘤细胞 ，下室参与FBS或某些特定的趋化因子 ，肿瘤细胞会向营养成分高的下室活动 ，从而从多孔膜一侧穿过 ，贴壁于多孔膜的另一侧 ，计数其细胞量可反映肿瘤细胞的迁徙或者侵袭能力（圆形通明幼孔为微孔）。（注：迁徙和侵袭是两个概想 ，迁徙是指细胞的活动能力 ，而侵袭是细胞在活动的同时会排泄出消化ECM的蛋白 ，断根活动阻碍 ，这个尝试更能仿照人体内环境）
当苦衷项
1.ECM Gel（货号：E1270）由Sigma公司出产 ，起源于大鼠赘瘤的细胞表基质提取物 ，保留在-20℃ ，由于在室温中会急剧凝固 ，不成逆 ，因而必要在冰上溶化和操作 ，同时所有要与ECM Gel接触的耗材也必要预冷 ，预防俩者接触时温差较大引起ECM Gel凝固粘附 ，造成浪费。
2.造作ECM Gel使用液时 ，先参与造就基 ，再参与ECM Gel ；同时在使用量的基础上多配置5-20 uL（使用量多就多配点） ，预防液体挂壁造成最后一次加样不够。
3.加胶时 ，胶的量以刚好把胶浸湿为最好（24孔的millicell必要35-40uL） ，过厚细胞侵袭变慢 ，过少则失去侵袭尝试的意思 ；实现后可轻轻地 ，均匀地拍打造就板四个侧面 ，让液体齐全平铺 ，这样能够预防由于胶的厚薄不均而引起的误差。
4.凝固功夫能够适当耽搁 ，但最好不要超过30min ，预防液体挥发使gel凝固得过硬。
5.通常先凭据细胞的侵袭能力估计每孔幼室参与的细胞数量 ，侵袭能力强的细胞（如231 ，CAF）每孔参与5,000个 ，那最后的细胞悬液应该造备成2.5x104/mL ，而侵袭能力弱的细胞（如MCF-7）能够提高细胞数量 ，达到10,000个 ，那最后的细胞悬液应该造备成5x104/mL。上层参与细胞悬液后可轻轻地 ，均匀地拍打造就板四个侧面 ，让液体齐全平铺 ，预防细胞散布不均而引起细胞计数时中央多双方少。
6.参与下室中的10%FBS是作为趋化因子诱导细胞活动 ，24孔板下室通常参与500μl含FBS的造就基 ，分歧的造就板加的量有分歧要求 ，具体请参考说明书。这里要出格把稳的是 ，基层造就液和幼室间 ；嵊衅莶 ，一旦产生气泡 ，气泡处的趋化作用就减弱甚至隐没了 ，在种板的时辰要出格留心 ，幼室在放入时倾斜缓慢放入（把稳幼室中的液体不要流出） ，能够预防气泡。造就功夫必要自己凭据文件做预尝试 ，寻找相宜的功夫点 ；功夫点的选择除了要思考到细胞细胞侵袭力表 ，细胞数及处置成分对细胞数主张影响也不成忽视 ，穿过的细胞数在100-200之间最好。棉签洗濯时肯定要柔和 ，预防戳破多孔膜。
7.结晶紫是细胞核染液 ，细胞大幼分歧 ，染色功夫也有扭转 ，染液搁置的功夫和浓度也会对染色功夫有影响 ，必要自己把握 ；最优的染色状态是细胞核色彩深 ，胞浆色浅。
